一、糞便標本的采集
糞便取樣時采集到病理成分是提高陽性率的基礎,配備的采集杯大有講究,不僅要適用于各種類型的標本,而且最好可以多點取樣,便于采集到病理成分。目前,常見配套的糞便采集器有勺狀、螺紋狀、多爪式等。勺狀取樣器無法多點采樣,螺紋狀取樣器無法取水樣便及稀便,多爪式勺狀,稀便硬便都可方便采集,且能多點取樣,病理成分更容易被采集到。
二、糞便標本的前處理
糞便樣本性狀多樣,差異明顯,若前處理不當,在顯微鏡下成像時,會極大地影響圖片效果及標本特征提取,從而干擾識別。常見的糞便標本處理包括直接涂片法和稀釋過濾法。直接涂片法以機器模擬手工操作方式,儀器自動取樣,在稀釋池稀釋成懸濁液后在載玻片上涂片后轉送至顯微鏡下采圖。這種方法保證了樣本的原始性,但在涂片的過程中,有形成分易變形和被破壞,糞便標本受食物殘渣的影響,難以保證圖像的清晰度。稀釋過濾法由儀器自動加入稀釋液,自動混勻、過濾,加樣至流動計數池或一次性計數板,傳送至顯微鏡下進行采圖。這種方法過濾掉了部分殘渣,可為鏡檢提供較好的視覺背景,但對糞便攪拌時間及力度要求較高,攪拌不充分,病理成分無法釋放,攪拌過度,病理成分易被破壞,所以,最好可根據糞便的性狀,自動調整攪拌速度、攪拌時間及沉降時間等,對每份標本進行個性化處理,得到最佳處理樣本懸液。
對糞便病理成分進行富集是提高陽性檢出率的關鍵,目前,樣本的過濾回收方法包括靜態過濾法及動態過濾法。靜態過濾法的過濾網固定在底部或一側,被動接受有形成分,回收率低,且糞便殘渣容易堵塞網孔,造成有形成分無法回收。動態過濾網有大小孔徑的雙層濾網,在攪拌過程中形成對沖液流,可主動捕撈有形成分,既能有效過濾食物殘渣又可防止網孔堵塞,可對病理成分(尤其是蟲卵)有效富集,提高回收率及檢出率。
圖像的采集及處理是糞便檢測實現自動化的難點,糞便標本成分復雜,如何采集到病理成分、采集圖片的數量及圖像的自動識別都至關重要。糞便標本干擾因素較多,在復雜的背景下捕抓到病理成分并采集圖像是關鍵,可根據糞便病理成分的大小、軸比、形狀、紋理、梯度、顏色、灰度等特征參數設置特定語義模型,在復雜背景下選擇性抓取疑似病理成分的目標并采集圖像。紅細胞、白細胞、蟲卵等病理成分經沉淀后聚集在標本懸液下層,而脂肪球漂浮在標本懸液上層,為保證不漏檢,需進行上下雙層面掃描,分層進行拍照和采集目標參數。原則上,儀器采集的視野越多,漏檢可能性越低,但難點在于既要保證采集視野數又要保證檢測速度。目前,糞便分析儀常見的顯微鏡物鏡有20倍單鏡頭和10倍+40倍雙鏡頭,應用雙鏡頭的儀器在低倍鏡下掃描后再轉高倍鏡采圖分析,問題在于受食物殘渣等影響,10倍低倍鏡下無法判斷識別病理成分,而40倍高倍鏡觀察的視野數又有限,容易導致漏檢。相比而言,20倍單鏡頭無需高低倍鏡轉換,既能保證病理成分清晰可見,又能使觀察視域更大,檢測的視野更多,提高陽性檢出率。圖像自動識別的準確度依賴于應用特征參數的多少及圖片庫的大小,儀器同人一樣,見識越多,自動識別率越高。
開展室內質控是保證糞便檢驗質量的必要措施,儀器需具備配套的糞便有形成分質控物、糞便隱血質控品及轉鐵蛋白質控品,對儀器進行質量控制,以保證檢測結果的準確性。糞便有形成分質控物需具備陰性質控物、靈敏度質控物及精密度質控物三種,分別用于陰性對照、檢出率驗證及重復性驗證。糞便隱血質控品及轉鐵蛋白質控品要包括陰性、低值、中值及高值四個濃度,分別用于糞便隱血及轉鐵蛋白檢測項目的陰性對照、靈敏度檢測、中等濃度及高濃度驗證。
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